بیش بیان ژن کدکننده آنزیم hmg-coa ردوکتاز به منظور افزایش تولید هترولوگ لینالول در مخمر ساکارومایسس سرویزیه

ترپنوئید ها دسته ای متنوعی از متابولیت های ثانویه هستند که بیش تر در بافت های گیاهی به عنوان جزء اصلی روغن های ضروری یافت می شوند. به دلیل کاربرد گسترده این ترکیبات در صنایع دارویی، آرایشی و غذایی تولید میکروبی این ترکیبات اخیرا بسیار مورد توجه قرار گرفته است. مخمر ساکارومایسس سرویزیه به دلیل وجود مسیر موالونات به طور طبیعی حاوی پیش ماده ضروری سنتز ترپنوئید ها (ipp ) است و از این رو پتانسیل تولید بسیاری از ترپنوئید ها را دارد. اما به دلیل اختصاص قسمت اعظم ipp موجود در سلول به سنتز ارگوسترول (محصول نهایی مسیر موالونات) و بنابراین کمبود ipp آزاد درون سلولی ، بیان دگر ساخت ترپنوئید ها به سنتز مقدار بسیار کمی از آنها در سلول های مخمر می انجامد. افزایش ipp آزاد درون سلولی عمدتا از طریق افزایش فعالیت آنزیم های کلیدی موجود در مسیر و جلوگیری از مصرف آن در راه تولید ارگوسترول میسر می شود. آنزیم hmg-coa ردوکتاز یکی از آنزیم های کلیدی مسیر موالونات است و بنابراین بالا رفتن میزان آن درسلول می تواند یکی از راهکار های افزایش ipp باشد. از سوی دیگر مهار ژن erg9 (کد کننده آنزیم اسکوالن) از طریق کاهش پیش ساز سنتز ارگوسترول، مانع از تخصیص ippهای موجود در سلول جهت سنتز ارگوسترول می گردد و بدین ترتیب محتوی ipp آزاد درون سلول را بالا می برد. لینالول یک مونوترپنوئید غیر حلقوی معطراست که در بسیاری از گیاهان گلدار و گونه های گیاهی یافت می شود. این مونوترپنوئید علاوه بر کاربرد در صنایع آرایشی و بهداشتی در درمان بیماریهایی مثل لوسمی و سرطان سینه نیز به کار می رود. هدف از این تحقیق تعیین اثر بیش بیان قسمت کاتالیتیک ژن hmg1 ( ژن کد کننده آنزیم hmg-coa ردوکتاز) و مهار ژن erg9 بر روی تولید لینالول و از این طریق دستیابی به سویه ای مخمری باقابلیت تولید بالای لینالول است. در اجرای این تحقیق ابتدا قسمت کاتالیتیک ژن hmg1( thmg1) تحت کنترل پروموتور gal10 در ناقل بیانی pesc-ura همسانه سازی شد. پس از آن با همسانه سازی ژن لینالول سنتاز ( lis) با استفاده از تکنیک gap repair در ناقل مذکور، سازواره pescura-hmg-lis ایجادگردید. به منظور بررسی اثر بیش بیان ژن thmg1 سازواره pescura -lis نیز ساخته شد. انتقال این دو سازواره به دو سویه erg9 و 5d منجر به ایجاد 4 سویه 5d- pesc-lis، 5d- pesc- hmg-lis، erg9- pesc-lis، erg9- pesc - hmg-lis گردید. جهت یافتن زمان مناسب برای نمونه برداری و استخراج لینالول تولید شده در کشت سلولی مورد استفاده، منحنی رشد سویه های موجود رسم شد. پس از استخراج لینالول با استفاده از روش استخراج فاز جامد، میزان سنتز لینالول طی آنالیزکروماتوگرافی گازی ( gc ) محاسبه گردید. بیش بیان ژن thmg1 از طریق بالابردن میزان ipp موجود در سلول و به بیان دیگر رفع محدودیت کمبود ipp در سلول ، باعث بالا دو برابر شدن میزان سنتز لینالول در 5d- pesc- hmg-lis نسبت به سویه 5d- pesc-lis شد. مشاهده میزان لینالول تولیدی توسط دو سویه erg9- pesc-lis و erg9- pesc - hmg-lis نشان می دهد که بیش بیان ژن thmg1 تغییر چندانی درمیزان سنتز لینالول ایجاد نکرد که احتمالا ناشی ازفعال شدن سیستم تنظیم بازخوری سلول و تولید ترکیبات جانبی به دنبال مهار ژن erg9 است . به طور کلی مقایسه غلظت لینالول در سویه های موجود نشان داد که در دو سویه erg9- pesc-lis، erg9- pesc - hmg-lis سنتز لینالول به مراتب بالاتر از دو سویه دیگر است . این مشاهدات بیانگر این است که کاهش تخصیص ipp های درون سلولی جهت سنتز ارگوسترول وتغییر مسیر متابولیسمی به سمت سنتز لینالول تأثیر بیشتری را نسبت به بیش بیان ژن thmg1 روی تولید این ترکیب اعمال کرده است. مهار ژن erg9 به تنهایی موجب سه برابر شدن سنتز لینالول در سلول های مخمر شد.